Human IRAK3 ELISA Kit

檢測(cè)原理: 
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人IRAK3抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中
的人IRAK3會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IRAK3抗體和辣根
過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？谷薎RAK3抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IRAK3結(jié)合、生物素與親和
素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化
物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)OD值，IRAK3濃度
與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中IRAK3的濃度。 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)
影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測(cè)。 
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)  
6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融。 
8. 如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先
做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。 
 
試驗(yàn)所需自備物品: 
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。 
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為50ng/mL）。
然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空
白孔0ng/mL。如配制25ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL50ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品
&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  
4. 生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用。 
5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋，如200μL/管） 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 
 50 25 12.5 6.25 3.125 1.563 0.781 0 ng/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。 
 
操作步驟: 
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次
實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前 15 分鐘
內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)。 
3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 
5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情 
況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。 
7. 每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液
的加入順序相同。 
8. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀
器，設(shè)置好檢測(cè)程序。 
9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。 
 
注意事項(xiàng)： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請(qǐng)按說明書提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。 
2. 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成
任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！ 
3. 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的
“預(yù)溫育"時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間控制在
10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)
板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。 
5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較
小，運(yùn)輸過程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前，請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗
體工作液、酶結(jié)合物工作液請(qǐng)根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)
配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection 
Ab時(shí)，一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋
過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次
用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。 
7. 顯色時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 
8. 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 
9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 
10. 安全：試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品
時(shí)，請(qǐng)按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。 
11. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外） 
12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！ 
結(jié)果判斷: 
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)
品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度
為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，
由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程
式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 
3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 
 
靈敏度、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性: 
●靈敏度：zui小可測(cè) 0.469ng/mL。 
●檢測(cè)范圍：0.781–50ng/mL。 
● 特異性：可檢測(cè)重組或天然的人 IRAK3，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。 
操作概要 
1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘 
2. 倒去孔內(nèi)液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右 
7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測(cè)量 OD 值 
8. 結(jié)果計(jì)算